desafíos en la extracción de ARN

Guía de resolución de problemas para la extracción de ARN total & Purificación

1. ¿Qué causa la degradación del ARN??
2. ¿Cómo se puede mejorar la extracción de ARN??
3. ¿Por qué es más difícil extraer el ARN que el ADN??
4. ¿Cómo se puede prevenir la contaminación del ADN durante el aislamiento del ARN??
5. ¿Cómo podemos proteger el ARN de la degradación??
6. ¿El autoclave destruye el ARN??
7. ¿Cómo se congelan las células para la extracción de ARN??
8. ¿Cómo se deshace del ARN??
9. ¿Cómo funciona la extracción de ARN??
10. Por qué se utiliza nitrógeno líquido en la extracción de ARN?
11. ¿Cuál es el propósito de la extracción de ARN??
12. ¿Qué es un buen rendimiento de ARN??

¿Qué causa la degradación del ARN??

Hay dos razones principales para la degradación del ARN durante el análisis de ARN. Primero, el ARN por su propia estructura es inherentemente más débil que el ADN. ... Esto hace que el ARN sea más lábil químicamente que el ADN. El ARN también es más propenso a la degradación por calor que el ADN..

¿Cómo se puede mejorar la extracción de ARN??

Hay 3 métodos efectivos para lograr esto:

1. Homogeneizar completamente las muestras inmediatamente después de la recolección en una solución de lisis celular de base caotrópica (p. Ej., Que contenga guanidinio) como el tampón de lisis disponible en el kit PureLink RNA Mini o el reactivo TRIzol.
2. Muestras de congelación instantánea en nitrógeno líquido.

¿Por qué es más difícil extraer el ARN que el ADN??

La razón principal es que el ARN es menos estable y más fácil de degradar en comparación con el ADN. ... El ARN tiene surcos más grandes que el ADN, lo que facilita el ataque de las enzimas. Las enzimas que degradan el ARN, las ribonucleasas (RNasas) son abundantes en el medio ambiente y es difícil eliminarlas por completo..

¿Cómo se puede prevenir la contaminación del ADN durante el aislamiento del ARN??

El problema a veces se puede evitar al restringir los cebadores para que atraviesen los límites de los intrones, pero esto a menudo es difícil y los métodos que se utilizan actualmente para reducir la contaminación del ADN incluyen la digestión de la ADNasa I, el fraccionamiento en gel, la extracción con fenol ácido: cloroformo y la precipitación con cloruro de litio..

¿Cómo podemos proteger el ARN de la degradación??

Para evitar la degradación, las muestras de ARN generalmente se almacenan congeladas a -20 ° C o -80 ° C o bajo nitrógeno líquido..

¿El autoclave destruye el ARN??

Asegúrese de separar los reactivos utilizados para el trabajo de ARN de los "reactivos de uso general" en el laboratorio. Todas las soluciones, excepto los tampones Tris, deben tratarse con DEPC al 0,1% (o DMPC) durante la noche a temperatura ambiente y luego esterilizarse en autoclave. El autoclave hidroliza y destruye DEPC y DMPC sin reaccionar.

¿Cómo se congelan las células para la extracción de ARN??

Coloque el tejido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o cónico de 15 ml y congele en hielo seco. Alternativamente, envuelva el tejido en papel de aluminio y congele con nitrógeno líquido.

¿Cómo se deshace del ARN??

La contaminación por ARN se puede eliminar agregando 2 microlitros de RNasa A (10 mg / ml, Fermentas) a 20 microlitros de ADN disueltos en tampón TE (Tris-EDTA, pH = 8.0) e incubar durante 3-4 ha 37 C.

¿Cómo funciona la extracción de ARN??

Métodos de extracción orgánica

Durante la centrifugación, la muestra se separa en tres fases: una fase orgánica inferior, una fase media que contiene proteínas desnaturalizadas y ADNg, y una fase acuosa superior que contiene ARN. La fase acuosa superior se recupera y el ARN se recoge mediante precipitación con alcohol y rehidratación..

Por qué se usa nitrógeno líquido en la extracción de ARN?

Se utiliza nitrógeno líquido ya que tiene una temperatura muy baja de -176 ° C que ayuda a pulverizar la sustancia dura de los tejidos vegetales y animales para convertirlos en polvo. También ayuda a desactivar la ADNasa para digerir el ADN. .

¿Cuál es el propósito de la extracción de ARN??

La extracción de ARN es la purificación de ARN de muestras biológicas. Este procedimiento se complica por la presencia ubicua de enzimas ribonucleasas en células y tejidos, que pueden degradar rápidamente el ARN..

¿Qué es un buen rendimiento de ARN??

Una A₂₆₀/A₂₈₀ una proporción superior a 1,8 suele considerarse un indicador aceptable de ARN de buena calidad con un nivel bajo de contaminación proteica [14, 15]. Una A₂₆₀/A₂₃₀ una proporción superior a 1,8 se utiliza como indicador de ARN extraído con un nivel bajo de contaminación por polisacáridos.