Problema de doble digestión de mapeo de restricción

1. ¿Por qué hay restricciones de doble digestión??
2. ¿Por qué no funciona mi resumen de restricciones??
3. ¿Qué sucede si agrega demasiada enzima de restricción??
4. ¿Pueden dos enzimas de restricción cortar en el mismo sitio??
5. ¿Cómo se calcula el resumen de restricción??
6. ¿Cuánto tiempo debe tomar un resumen de restricción??
7. ¿Es necesaria la inactivación por calor de las enzimas de restricción??
8. ¿Caducan las enzimas de restricción??
9. ¿Cómo se puede prevenir la digestión por restricción??
10. ¿Por qué no cortaría una enzima de restricción??
11. ¿Cómo se seleccionan las enzimas de restricción??
12. ¿Por qué las enzimas de restricción deben mantenerse en hielo??

¿Por qué hay restricciones de doble digestión??

La digestión de un sustrato de ADN con dos endonucleasas de restricción simultáneamente (doble digestión) es un procedimiento común que ahorra tiempo. Es una consideración importante seleccionar el mejor NEBuffer para proporcionar condiciones de reacción que optimicen la actividad enzimática y eviten la actividad estrella asociada con algunas enzimas..

¿Por qué no funciona mi resumen de restricciones??

Digestión incompleta o nula debido a la actividad enzimática bloqueada por la metilación del ADN. Si su enzima está activa y digiere el ADN de control y la reacción se configura en condiciones óptimas, pero aún observa problemas con la digestión, podría deberse a que la enzima está inhibida por la metilación del ADN molde..

¿Qué sucede si agrega demasiada enzima de restricción??

La digestión incompleta puede ocurrir cuando se usa demasiada o muy poca enzima. La presencia de contaminantes en la muestra de ADN puede inhibir las enzimas, lo que también resulta en una digestión incompleta..

¿Pueden dos enzimas de restricción cortar en el mismo sitio??

Puede hacerlo con los controles adecuados, como la digestión de restricción única y las dos enzimas juntas, para asegurarse de que ambas estén cortando de forma independiente y conjunta y seguir adelante con sus planes. Desafortunadamente, estaba restringido a estas dos enzimas que tenían sitios uno al lado del otro.!

¿Cómo se calcula el resumen de restricción??

Calcula la cantidad de cada uno que necesitas agregar a una digestión de restricción para digerir 5ug (5000ng) de ADN con 5 unidades de enzima. Por ejemplo, si mi ADN tiene 190 ng / ul, necesitaría: 5000ng / 190ng / ul = 26 ul de mi muestra.

¿Cuánto tiempo debe tomar un resumen de restricción??

* Pro-Tip * Dependiendo de la aplicación y la cantidad de ADN en la reacción, el tiempo de incubación puede oscilar entre 45 minutos y toda la noche. Para los resúmenes de diagnóstico, a menudo es suficiente 1-2 horas. Para resúmenes con >1 µg de ADN utilizado para la clonación, se recomienda digerir durante al menos 4 horas.

¿Es necesaria la inactivación por calor de las enzimas de restricción??

Preguntas frecuentes: ¿Es necesario inactivar las enzimas de restricción después de la digestión del vector? La inactivación de endonucleasas de restricción generalmente no es necesaria, pero en algunos casos podría aumentar la eficiencia de transformación..

¿Caducan las enzimas de restricción??

Todas las enzimas se analizan para determinar su actividad cada 3-6 meses; la fecha de vencimiento se indica en la etiqueta adjunta a cada vial de enzima. Después de treinta y cinco años de experiencia con enzimas de restricción, hemos descubierto que la mayoría son muy estables cuando se almacenan a -20 ° C en el tampón de almacenamiento recomendado..

¿Cómo se puede prevenir la digestión por restricción??

Protocolo de digestión de enzimas de restricción

1. Agregue componentes a un tubo limpio en el orden que se muestra: ...
2. Incubar la reacción a la temperatura de digestión (generalmente 37 ° C) durante 1 hora..
3. Detenga la digestión mediante inactivación por calor (65 ° C durante 15 minutos) o agregando una concentración final de 10 mM de EDTA.
4. El ADN digerido está listo para su uso en aplicaciones de investigación..

¿Por qué no cortaría una enzima de restricción??

Preguntas frecuentes: ¿Por qué mi enzima de restricción no corta el ADN? ... Si el ADN de control se escinde y el ADN experimental resiste la escisión, los dos ADN se pueden mezclar para determinar si hay un inhibidor presente en la muestra experimental. Si hay un inhibidor (a menudo sal, EDTA o fenol), el ADN de control no se cortará después de mezclar..

¿Cómo se seleccionan las enzimas de restricción??

Al seleccionar enzimas de restricción, desea elegir enzimas que:

1. Flanquee su inserto, pero no corte dentro de su inserto.
2. Están en la ubicación deseada en el plásmido receptor (generalmente en el sitio de clonación múltiple (MCS)), pero no cortes en ninguna otra parte del plásmido..

¿Por qué las enzimas de restricción deben mantenerse en hielo??

¿Realmente es necesario mantener las enzimas en hielo todo el tiempo? ... Las enzimas deben almacenarse y utilizarse a sus temperaturas óptimas. Las enzimas se almacenan generalmente en glicerol a -20ºC. Esto evita que se congelen por completo, lo que provoca la desnaturalización de las proteínas y da como resultado una pérdida de actividad..